Digestion and separation step

이차원 전기 영동(2 dimensional electrophoresis)에서 혈액, 세포주 샘플의 경우 분쇄과정이 불필요하나, frozen tissue의 경우 homogenizer로 먼저 물리적으로 조직 분쇄한다. 분쇄된 조직은 protease inhibitor가 포함된 용매에 녹인 후 pH gradient strips을 이용하여 1차원 전기영동을 시행하여 pH에 따라 좌우로 먼저 분리한 다음(isoelectric focusing), sodium dodecyl sulfate polyacrylamide slap gel (2D SDS gel)을 이용하여 분자량(molecular weight)에 따라 위아래로 전기영동으로 분리하여 이차원 전기영동을 완성한다[5,7]. 이렇게 분리된 단백질은 각각을 분리 채취하여, 이온화하여 질량분석기를 통해 각각이 어떤 단백질인지 확인하는 단백질 분석(identification)과정으로 넘어간다. 초기의 단순 이차원 전기영동에서 발전된 형태인 차별화 젤 전기영동(differential gel electrophoresis, DIGE)도 시행되고 있다. 이는 세 가지 조직을 서로 다른 형광염료(Cy5, Cy3, Cy2)로 염색 후 같은 젤에 올려 분석함으로써 세 조직에서의 단백질 발현율을 보다 정확하게 비교할 수 있겠다[8]. 이러한 이차원 전기영동을 기반으로 한 프로테오믹스 방법은 비교적 간단하면서 저렴한 비용으로 시행할 수 있다. 하지만, 노동 집약적이며 시간이 많이 소요되며 자동화가 어렵다. 또한 강산, 강염기를 가진 단백질과 수용성 단백질이 아닌 단백질의 경우 분석이 어렵다. 이런 여러 문제를 극복하기 위해 나온 기술이 액체 크로마토그래피 기술과 함께 질량분석이 결합된 방식이다(liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS). 액체 크로마토그래피에서 혼합물을 분리하고, 분리된 개개의 분석물은 이온화 장치에서 이온으로 만든 후 질량분석기로 분석을 하게 된다. LC/MS기술은 이차원 전기영동에 비해 비교적 실험시간이 짧고 자동화가 가능하여 크게 각광을 받고 있다(Fig. 2) [9]. 다중 단백질 동정기술(multi-dimensional protein identification technique, MudPIT)은 최근 개발된 2D LC분리 기술로 양이온 교환 column과 역상 column이 포함되어 있으며 향상된 컴퓨팅 기술로 전체 단백질 발현을 분석한다.

Fig. 2.

Flow chart of general proteomic analysis.

Mass analysis step using mass spectrometry

질량분석기는 물질을 이온화시켜 질량 대 전하의 비(m/z)를 측정하는 방식으로 분자량을 측정하고 이온의 fragmentation pattern을 분석하여 분자의 구조를 규명하는 분석방법을 이용하는 질량분석법을 이용하는 장비이다[10]. 프로테움의 분석은 단백질을 이온화하는 질량 분석기를 이용함으로써 큰 발전을 이루었다. 단백질의 이온화는 펩타이드 같은 비휘발성 물질을 기체 이온으로 만들어 질량분석을 하게 만들어 단백질의 변형 또는 파편화 없이 분석이 가능하게 하였다. 단백질을 이온화 하는 방법은 크게 electrospray ionization (ESI)와 matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)로 나눌 수 있다.

ESI의 경우 용액 상태의 조직샘플을 electrical potential을 가한 상태에서 가는 분사바늘을 통해 대기 중으로 분무하여 기체 이온을 생성하게 된다[11]. MALDI는 단백질에 nanosecond laser pulse를 조사하여 이온화한 다음, 이온화된 펩타이드는 진공관을 통하여 이동하여 detector로 도달하게 되며, 질량분석기(peptide mass fingerprint)를 통하여 분자량을 계산하게 된다[12].

Protein identification step using data base

질량분석기로 분석된 단백질은 MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu), Mascot (http://www.Matrixscience.com) 등의 검색엔진의 데이터베이스를 통하여 동일한 무게와 피크 값을 가지는 단백질을 동정하게 된다[7].

이차원 전기영동을 이용한 단백질 정량연구

동정된 단백은 reference map과의 비교를 통해 각 샘플별로 단백의 증감을 측정이 가능하다(Fig. 3A, B). 이차원 전기영동 젤을 staining 후 고화질의 scanner와 PD-Quest software (Bio-rad)를 통해 데이터를 모은 후 각 환자별로 또는 각 질환별 단백질 발현들을 측정 후 비교 가능하다. 이를 통해 임상정보와 단백질 발현 여부를 통해 통계적인 분석으로 암 조직에 발현 증가를 보이는 단백질의 통계적 분석을 시행한다[7].

Fig. 3.

Clinical validation of identified protein. (A) A representative image of silver-stained 2-imensional electrophoresis gel and identified protein (red arrow). (B) Zoomed regions of the gel image and identified protein (red square) from normal and cancer tissues of 6 gastric cancer patients. (C) Protein expression of 5 gastric cancer cell lines using Western blot analysis. (D) Protein expression of gastric cancer patients using Western blot analysis. Protein expression is higher in cancer tissue than in normal tissue.

세포주와 조직에서 단백질 발현의 정량화를 통한 임상적 평가

동정된 단백은 항체를 이용한 Western blot을 통하여 세포주와 암 조직에서 발현여부를 확인한다(Fig. 3C, D). 조직에서 확인된 단백의 경우 면역화학염색을 통한 실제 암 조직에서의 발현을 확인한다. 이때 대량 환자군 연구에는 tissue microarray (TMA)가 유용하게 쓰인다[13]. TMA란 미리 만들어진 파라핀 블록에 일정한 크기의 조직을 심어 대량 환자를 한 슬라이드에 넣어 대량 연구에 쓰는 기법이다. Fig. 4A와 같이 종양조직을 한 샘플당 2 mm로 한다면 한 장의 슬라이드에 약 60명의 조직을 넣을 수 있다. 이러한 TMA의 장점은 염색 시 동일한 조건으로 시행함으로써 실험 조건을 같게 할 수 있고, 경제적으로도 360장의 염색을 6장으로 해결할 수 있어 매우 이득이다. 로봇을 이용하여 TMA를 제작하는 경우에는 더 작은 크기도 슬라이드에 넣을 수 있다. 환자의 TMA stage, cell type, survival이나 재발 여부 등의 환자 정보와 함께 종양조직에서 단백질 발현 여부를 정량화(Fig. 4B)하여 분석함으로써 단백질의 바이오 마커로서 가능성을 평가할 수 있다.

Figure 4.

Tissue microarray (TMA) and immunohistochemistry scoring. (A) Flow chart of TMA. (B) Immunohistochemical scores according to tissue expression on a numerical scale of 1+ to 4+ (×200).