Hypermethylation of human mut L homologue 1 (
Total of 487 sporadic colorectal cancer patients in CHA Bundang Medical Center were collected. MSI was identified when two or more are positive among five microsatellite markers (BAT25, BAT26, D17S250, D5S346, D2S123). The others were classified as microsatellite stable (MSS). Polymorphism of
MSI was observed in 65 of 487 patients (12.73%). MSI colorectal cancers showed similar clinicopathological features with previously reported; younger age onset, right-sided preponderance, mucinous and poorly differentiated histology, lower stage, fewer lymph node metastases than MSS tumors (each P<0.05). The frequency of
This study demonstrated higher frequency of
1990년 Fearon과 Vogelstein [
초기 가족성샘종폴립증(familial adenomatous polyposis)과 유전성 비폴립대장암(hereditary non-polyposis colon cancer) 두 유전성 질환 을 바탕으로 염색체 불안정성 경로(chromosomal instability: CIN pathway)와 현미부수체 불안전성 경로(microsatellite instability: MSI pathway), 두 대표적인 경로가 밝혀졌으며 이는 산발성 대장암에서 도 적용되어 약 85%정도 대부분의 경우엔 염색체 불안정성에 의해, 약 15%에서는 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI)에 의해 대장암이 발생하는 것으로 보고되고 있다[
현미부수체는 짧게 반복되는 염기서열 부분을 말하는데 반복적인 유전자 복제과정 중에서 변이가 일어나기 쉬운 부분으로 정상세 포에서는 DNA 부정교합 교정 시스템(mismatch repair system)에 의해 복구가 된다. 현미부수체 불안정성은 암세포에서 부정교합 교정 의 결함으로 인해 정상세포와 달리 길이 변화가 초래된 상태로 유전 성비폴립대장암의 경우에는 human mut L homologue 1 (
CpG 섬(CpG island)은 유전자 촉진자 부위의 40% 이상을 차지하는 DNA 부위로 과메틸화가 발생하게 되면 유전자 발현이 억제되어 결과적으로 유전자 불활성화를 일으킨다. 부정교합 교정 유전자나 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 촉진자 부위 과메틸화는 암발생의 중요 기전으로 작용하여 이를 CpG 섬 메틸화 표현형(CpG island methylator phenotype, CIMP) 경로라 하여 또 다른 발암경로로 분류하기도 한다. 과메틸화가 관찰되는 대장암에서 전구 병변으로 기존의 고전적인 샘암종연쇄를 따르지 않고 톱니 모양 병변(serrated lesion)으로부터 발생한다 하여 이를 톱니모양 경로(serrated pathway)라 명하기도 한다[
현미부수체 불안정성 산발성 대장암은 대부분이 톱니용종(serrated polyp)으로 기원되며
DNA 메틸화 과정에 엽산대사가 중요하게 관여하며 엽산대사의 장애는 메틸화의 이상을 초래해 발암에 기여하게 된다. 이 엽산대사 과정에서 효소 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)가 중요한 역할을 담당한다.
대장암에서 엽산대사에 중요한 효소인
2003년 3월부터 2010년 2월까지 분당차병원에서 원발성 대장암으로 수술받은 487명을 대상으로 분석하였다. 대장암 환자군은 모두 산발성으로 가족성샘종폴립증과 유전성비폴립대장암 등은 제외하였다. 본 연구는 분당차병원 의료윤리위원회로부터 연구 승인을 받았다.
종양은 포르말린으로 고정된 파라핀 포매 조직을 haematoxylin-eosin으로 염색한 후 현미경 유도하에서 7 µm의 두께로 미세 절제하였다. 정상조직은 종양으로부터 최소 1 cm 떨어진 조직을 미세 절제하였다. DNA추출을 위해서 미세 절제된 조직을 밤 동안 56°C에서 0.5% tween (Sigma, St. Louis, MO, USA), 100 mM Tris-Hcl buffer (pH 7.6), 1 mM EDTA, 그리고 20 µg proteinase K (Sigma)를 이용하여 배양하였다. Proteinase K는 차후에 95°C에서 10분 동안의 배양으로 인하여 불활성화되었고, 추출된 DNA는 사용할 때까지 영하 20°C에서 보관되었다. MSI를 확인하기 하여 미국국립암연구소(National Cancer Institute, NCI; Bethesda, MD, USA)에서 권장하는 BAT25, BAT26, D17S250, D5S346, D2S123 5가지 표지자를 이용하여 정상조직과 종양조직에 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR을 위해 10 pM primer, 1.5 mM MgCl2 20 µL, deoxyribonucleoside triphosphate 각각 0.2 mM, 0.75 U Taq polymerase (TaKaRa, Mountain View, CA, USA)를 혼합하여 25 µL의 반응액을 준비하였다. PCR은 94°C에서 15분간 초기 변성 후, 94°C에서 30초, 56°C에서 30초, 72°C에서 30초를 45주기 동안 시행한 후 마지막으로 72°C에서 10분간 연장반응을 실시하였다. PCR 산물은 ethanol로 침전시키고
현미부수체 불안정성 분류에서는 NCI의 제안에 따라 5개의 표지자 중에서 2개 이상 allelic shifting이 보이면 microsatellite-high (MSI-H)로 1개 이상 양성을 보이면 microsatellite-low (MSI-L)군으로 분류하나 아직까지 MSI-L군은 뚜렷한 특징이 밝혀지고 않으며 임상적 특징이 현미부수체 안정(microsatellite stable, MSS)군과 차이가 없어 MSS군으로 함께 분류되기도 한다. 본 연구에서도 MSI-L군을 MSS군에 포함시켜 MSI군과 MSS군 두 군으로 나누어 각각의 성별, 나이, 종양의 위치, 종양의 크기, 종양의 병기, 조직학적 분화도, 림프-혈관 침윤(lymphovascular invasion), 암종배아항원(carcinoembrionic antigen, CEA) 수치 및
MTHFR의 분석을 위하여 정상 DNA를 대상으로 하였다. 환자의 말초 혈액의 림프구를 채취하여 DNA를 추출하였다.
통계적 분석은 chi-square test 또는 Fischer exact test 통계기법을 사용하였고 양측검정을 사용하였다. 분석 도구는 IBM SPSS ver. 20.0(IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하고, P값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 의미가 있다고 판정하였다.
대상자 총 487명 중 남성은 전체 281명, 여성은 206명이었다. 전체 평균연령은 62.41±12.21세였다. MSI군은 62명이었으며 MSS군은 425명으로 MSI군은 전체 12.73%의 빈도를 보였다. MSI군은 평균연령이 59.2± 15.02세이고 MSS군은 평균연령이 67.9± 11.69세로 MSI군의 평균연령이 낮았으며 50세 이하 비율도 32.2%이고 MSS군은 50세 이하가 15.3%로 MSI군에 젊은 층이 많이 분포하였다(P< 0.001). 두 군 간 남녀 성비의 차이는 없었다.
암의 분포 위치는 MSI군의 62.9%가 우측에 분포하였고 MSS군은 72.2%가 좌측에 분포하였다(P< 0.001). 암의 평균 크기는 MSI군이 6.45± 2.63 cm로 MSS군의 5.38± 2.18 cm보다 컸다(P< 0.001). MSI군은 전체 병기에서 69.4%가 I, II기에 속하였으며 III기가 29%, IV기가 1.6%로 환자 전체에서 III, IV기 비율이 각각 39.8%, 7.0%임과 비교하여 진단 시 병기가 낮았다(P= 0.037). T병기에서는 전체적으로 비교군 간에 차이가 없었으며 N병기에서 MSI군은 N0가 71%, MSS군은 N0가 51.3%로 림프절 전이가 낮은 경향을 보였다. 조직학적 분화도에서도 MSI군이 저분화도(poorly differentiated type)와 점액성(mucinous type)의 분포가 27.4%로 MSS군 10.4% 분포와 비교하여 유의한 차이를 보였다(P< 0.001). 림프-혈관 침윤 소견은 MSS군이 53.4%로 MSI군 32.3%보다 높게 나타났다. CEA 수치는 연구기간 중 기준치 값의 변경이 있어 정상범위와 비정상범위로 나누어 구분하였고 비교군 간에 차이는 없었다. 표에 명시되는 않았지만 평균 CEA 값은 MSI군이 10.34±26.10 μg/mL, MSS군이 16.64±99.73 μg/mL로 MSI군이 낮게 나왔으나 통계적으로 유의하지는 않았다(
전체 487명 중 CC형 161예(33.1%), CT형 253예(52.0%), TT형 74예(15.0%)였다. MSI군에서는 전체 62명 중 CT형이 59.7%, TT형이 17.7%로 변이형이 빈도수가 다소 높았다. TT형의 교차비(odds ratio, OR)는 1.86으로 현미부수체 불안정성과 높은 관련성을 보였으나 통계적인 유의성은 보이지 않았다(P=0.17).
대장암은 우리나라뿐만 아니라 미국, 유럽 등 다른 선진국에서 높은 발생률과 증가율을 보이고 있는 암이다. 분자생물학의 발전을 토대로 발암기전에 대한 많은 연구들이 이루어져 현재는 대장암이 단순히 하나의 일련과정을 따르는 질환이 아니라 다양한 전구 병변과 분자 경로, 다양한 예후를 보이는 암종의 복합체라는 것이 밝혀지고 있다[
샘종으로부터 출발하여
Jass [
본 연구의 결과에서도 MSI군은 12.73%로 비슷한 분포를 보이며 MSI군과 MSS군을 비교하였을 때 남녀 성비의 차이는 없었으나 MSI군이 보다 젊은 연령층에 분포하였으며 이는 50세 이하가 차지하는 비율이 32.3%로 MSS군 15.3%에 비해 두 배 정도로 확연히 차이가 났다. 암 발생 위치가 우측에 차지하는 비율이 62.5%로 전체 32.2%에 비하여 뚜렷이 우측에 호발하는 경향을 보이며 암 크기가 MSS군보다 컸고 조직학적으로도 저분화도 및 점액성 비율이 높았고 이는 모두 통계적으로도 유의한 결과를 보였다. 본 연구에서 생존율 분석이 이루어지지는 않았지만 전체 암 병기 중 I, II기가 차지하는 비율이 MSS군에 비해 높은 점, 림프절 전이가 적은 점, 림프-혈관 침윤이 적은 점들이 양호한 생존율에 영향을 미칠 것으로 여겨진다.
지금까지 알려진 대표적인 상유전적 변이들로는 저메틸화와 암 유전자 활성, 과메틸화와 종양억제 유전자 발현 소실, 염색질(chromatin) 단백변이, loss of imprinting로 크게 네 가지가 있다[
엽산 대사에 중심 역할을 하는
엽산의 섭취가 불충분할 때는 효소의 활성도가 낮은
효소의 활성도가 낮은 변이형들에서 촉진자 부위의 과메틸화의 증가를 보여주는 선행연구도 있다. Oyama 등[
따라서
본 연구에서는 비록 통계적으로 유의한 결과를 보이지는 않았지만 MSI군에서 TT형이 차지하는 비율이 17.7%로 MSS군의 14.6% 보다 다소 높았고 OR값이 1.86로 현미부수체 불안정성과 더 강한 관련성을 보여주고 있다.
Shannon 등[
그러나 상반된 결과를 보고하는 연구도 있다. Toffoli 등[
Hubner 등[
아직 모든 연구에서 어떠한 한 방향으로 기울어지는 일치된 결과를 보여주고 있지는 않지만 지금까지 보고된 연구 중 가장 많은 대상자를 다룬 Hubner 등[
그러나 본 연구에서나 Hubner 등[
본 연구결과에서는 현미부수체 불안정성 산발성 대장암이 다른 대장암과 구별되는 특징을 가지며 현미부수체 불안정성 대장암에서
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This study was supported by a grant from the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2009-0093821 and NRF-2012R1A1A2007033).
Comparison of clinicopathologic features between MSI and MSS
Factors | MSI (n = 62) | MSS (n = 425) | Total (n = 487) | P-value |
---|---|---|---|---|
Sex | 0.831 | |||
Male | 35 (56.5) | 246 (57.9) | 281 (57.7) | |
Female | 27 (43.5) | 179 (42.1) | 206 (42.3) | |
Age (yr) | ||||
Mean | 59.23 ± 15.02 | 62.87 ± 11.69 | 62.41 ± 12.21 | 0.028 |
≤ 50 | 20 (32.3) | 65 (15.3) | 85 (17.5) | 0.001 |
Location | < 0.001 | |||
Rignt | 39 (62.9) | 118 (37.1) | 157 (32.2) | |
Left | 23 (27.8) | 307 (72.2) | 330 (67.8) | |
Tumor size (cm) | 6.45 ± 2.63 | 5.38 ± 2.18 | 5.38 ± 2.38 | < 0.001 |
TNM stage | 0.037 | |||
I | 8 (12.9) | 41 (9.60) | 49 (10.1) | |
II | 35 (56.5) | 175 (41.2) | 210 (43.1) | |
III | 18 (29.0) | 176 (41.4) | 194 (39.8) | |
IV | 1 (1.6) | 33 (7.8) | 34 (7.0) | |
T stage | 0.741 | |||
T1 | 3 (4.8) | 26 (6.1) | 29 (6.0) | |
T2 | 7 (11.3) | 33 (7.8) | 40 (8.2) | |
T3 | 47 (75.8) | 322 (75.8) | 369 (75.8) | |
T4 | 5 (8.1) | 44 (10.4) | 49 (10.1) | |
N stage | 0.015 | |||
N0 | 44 (71.0) | 218 (51.3) | 262 (53.8) | |
N1 | 10 (16.1) | 111 (26.1) | 121 (24.8) | |
N2 | 8 (12.9) | 96 (22.6) | 104 (21.4) | |
Histological differentiation | < 0.001 | |||
WD+MD | 45 (72.6) | 380 (89.4) | 425 (87.3) | |
PD+MUC | 17 (27.4) | 45 (10.6) | 62 (12.7) | |
Lymphovascular invasion | 0.002 | |||
Positive | 20 (32.3) | 227 (53.4) | 247 (50.7) | |
Negative | 42 (67.7) | 198 (46.4) | 240 (49.3) | |
CEA level | 0.639 | |||
Abnormal | 21 (33.9) | 157 (36.9) | 178 (36.6) | |
Normal | 41 (66.1) | 268 (63.1) | 309 (63.4) |
Values are presented as mean±SD or number (%).
MSI, microsatellite instability; MSS, microsatellite stable; TNM, tumor, nodes, metastasis; WD, well differentiated; MD, moderately differentiated; PD, poorly differentiated; MUC, mucinous type; CEA, carcinoembrionic antigen.
Relationship between
MSI (n = 62) | MSS (n = 425) | Total (n = 487) | Odds ratio (95% CI) | P-value | |
---|---|---|---|---|---|
CC | 14 (22.6) | 147 (34.6) | 161 (33.1) | Reference | |
CT | 37 (59.7) | 216 (50.8) | 253 (52.0) | 1.80 (0.91-3.73) | 0.09 |
TT | 11 (17.7) | 62 (14.6) | 73 (15.0) | 1.86 (0.72-4.69) | 0.17 |
CC+CT | 51 (82.3) | 363 (85.4) | 414 (85.0) | Reference | |
TT | 11 (17.7) | 62 (14.6) | 73 (15.0) | 1.26 (0.56-2.63) | 0.57 |
CC | 14 (22.6) | 147 (34.6) | 161 (33.1) | Reference | |
CT+TT | 48 (77.4) | 278 (65.4) | 326 (66.9) | 1.81(0.94-3.68) | 0.06 |
Values are presented as number (%).
MTHFR, methylenetetrahydrofolate; MSI, microsatellite instability; MSS, microsatellite stable; CI, confidence interval.